Може ли вътрешният филтър да повлияе на количественото определяне на нуклеиновите киселини чрез флуоресценция?
Базираното на флуоресценция количествено определяне на нуклеиновите киселини се превърна в незаменима техника в съвременната молекулярна биология, биохимия и свързаните с тях области. Той предлага висока чувствителност, специфичност и възможност за извършване на измервания в реално време. Различни фактори обаче могат да повлияят на точността на тези измервания и един такъв фактор, който често остава незабелязан, е ефектът на вътрешния филтър. Като водещ доставчик на вътрешни филтри, аз съм добре запознат с влиянието, което тези компоненти могат да окажат върху количественото определяне на нуклеинови киселини, и ще се задълбоча в тази тема подробно.
Разбиране на базираното на флуоресценция количествено определяне на нуклеинова киселина
Флуоресцентното количествено определяне на нуклеиновите киселини обикновено се основава на използването на флуоресцентни багрила, които се свързват специфично с нуклеиновите киселини. Тези багрила, като SYBR Green, етидиев бромид или PicoGreen, излъчват светлина с определена дължина на вълната, когато са възбудени от подходящ източник на светлина. Интензитетът на излъчваната флуоресценция е пропорционален на количеството нуклеинова киселина, присъстващо в пробата, което позволява количествено определяне.
Процесът включва смесване на пробата от нуклеинова киселина с флуоресцентното багрило, инкубиране на сместа, за да се позволи свързването, и след това измерване на интензитета на флуоресценция с помощта на флуорометър или подобен инструмент. Измерената флуоресценция се сравнява със стандартна крива, генерирана с помощта на известни концентрации на нуклеинови киселини, и се определя концентрацията на неизвестната проба.
Какво представлява ефектът на вътрешния филтър?
Ефектът на вътрешния филтър е явление, което възниква, когато абсорбцията на светлина от дадена проба повлияе на измерването на флуоресценцията. Има два вида ефекти на вътрешния филтър: първичен и вторичен.
Първичният ефект на вътрешния филтър възниква, когато пробата абсорбира възбуждащата светлина. В резултат на това по-малко светлина достига до флуорофора (флуоресцентното багрило), което води до намаляване на количеството светлина, налично за възбуждане. Това води до намаляване на интензитета на флуоресценцията, което прави пробата да изглежда с по-ниска концентрация на нуклеинови киселини, отколкото в действителност.
Ефектът на вторичния вътрешен филтър, от друга страна, се случва, когато пробата абсорбира излъчената флуоресцентна светлина. Погълнатата светлина не се открива от флуорометъра, което отново води до подценяване на концентрацията на нуклеинова киселина.
Как вътрешният филтър влияе върху количественото определяне на нуклеинови киселини
Когато се извършва количествено определяне на нуклеинова киселина чрез флуоресценция, наличието на вътрешни филтърни ефекти може значително да изкриви резултатите. Високите концентрации на нуклеинови киселини, наличието на замърсители или използването на флуоресцентни багрила с висока концентрация могат да допринесат за ефекта на вътрешния филтър.
Например, в проба с висока концентрация на нуклеинови киселини, комплексът нуклеинова киселина - багрило може да абсорбира голямо количество от възбуждащата светлина, което води до ефект на първичен вътрешен филтър. По същия начин, ако пробата съдържа замърсители, които абсорбират светлина при дължини на вълната на възбуждане или излъчване, това също може да доведе до ефекти на вътрешния филтър.
В някои случаи ефектът на вътрешния филтър може да бъде толкова тежък, че да направи резултатите от количественото определяне напълно ненадеждни. Това е особено проблематично в приложения, където точното количествено определяне е от решаващо значение, като например при анализ на генна експресия, полимеразна верижна реакция (PCR) и секвениране от следващо поколение.
Решения за вътрешни филтри от нашата компания
Като доставчик на вътрешни филтри, ние предлагаме набор от висококачествени вътрешни филтри, предназначени да сведат до минимум ефекта на вътрешния филтър при количествено определяне на нуклеинова киселина, базирано на флуоресценция. НашитеМаслен филтър 0AWе специално разработен, за да намали абсорбцията на светлина при дължините на вълните на възбуждане и излъчване, които обикновено се използват при количественото определяне на нуклеинови киселини. Изработен е от материали с висока чистота, които имат ниска автофлуоресценция, което гарантира точни и надеждни измервания.
Нашите0DD - 0027 - Голям вътрешен филтър AM с магнит 0DD 325 429 A 0DD Трансмисияе друг отличен вариант. Вграденият магнит позволява лесно инсталиране и премахване, а големият му размер го прави подходящ за използване в различни обеми на проби. Този филтър ефективно намалява ефекта на вътрешния филтър, подобрявайки точността на количественото определяне на нуклеинова киселина.
TheDTF630 - 0025 - AM вътрешен филтър, дълъг квадрат с магнит 1726302DT000 DTF630 трансмисиясъщо е популярен избор. Неговият уникален дълъг квадратен дизайн осигурява подобрена филтрация на светлината, минимизирайки въздействието на ефекта на вътрешния филтър. Той е съвместим с много флуорометри и може да се използва както в изследователски, така и в клинични условия.
Стратегии за смекчаване на ефектите от вътрешния филтър
В допълнение към използването на нашите висококачествени вътрешни филтри, има няколко стратегии, които могат да бъдат използвани за смекчаване на ефекта на вътрешния филтър при количественото определяне на нуклеинова киселина.
Разреждането на пробата е прост, но ефективен метод. Чрез разреждане на пробата се намалява концентрацията на нуклеинови киселини и замърсители, което от своя страна намалява абсорбцията на светлина и ефекта на вътрешния филтър. Въпреки това, този подход може да не е подходящ за проби с ниски концентрации на нуклеинова киселина.
Използването на подходящи кювети или микроплаки също може да помогне. Кювети с по-малка дължина на пътя могат да намалят количеството светлина, погълнато от пробата, минимизирайки ефекта на вътрешния филтър. Освен това използването на кювети или микроплаки, направени от материали с ниска автофлуоресценция, може да подобри точността на измерванията.
Друга стратегия е да се оптимизира концентрацията на флуоресцентното багрило. Използването на оптимална концентрация на багрилото може да осигури максимално свързване с нуклеиновите киселини, като същевременно минимизира ефекта на вътрешния филтър, причинен от самото багрило.
Заключение
Ефектът на вътрешния филтър може да окаже значително влияние върху количественото определяне на нуклеиновите киселини чрез флуоресценция. Това може да доведе до неточни резултати, което може да има сериозни последствия при различни изследвания и клинични приложения. Като доставчик на вътрешни филтри, ние се ангажираме да предоставяме висококачествени вътрешни филтри, които могат ефективно да намалят ефекта на вътрешния филтър и да подобрят точността на количественото определяне на нуклеинова киселина.
Ако сте изправени пред предизвикателства с ефектите на вътрешния филтър във вашите експерименти за количествено определяне на нуклеинова киселина или се интересувате да научите повече за нашите продукти с вътрешен филтър, препоръчваме ви да се свържете с нас за по-нататъшно обсъждане и потенциална доставка. Нашият екип от експерти е готов да ви помогне да намерите най-добрите решения за вашите специфични нужди.
Референции
- Lakowicz, JR (2006). Принципи на флуоресцентната спектроскопия. Springer Science & Business Media.
- Van Cauteren, D., Van Hecke, K., & Van Meervelt, L. (2010). Ефекти на вътрешния филтър във флуоресцентната спектроскопия: преглед на урока. Аналитична и биоаналитична химия, 398 (3), 1091 - 1109.
- Giraldo, JP, & Kelly, SM (2012). Ефекти на вътрешния филтър във флуоресцентната спектроскопия: клопки и възможни решения. Химически съобщения, 48 (87), 10802 - 10804.
